我国啤酒酵母育种技术的进展

一、前言随着中国经济的不断发展，人们生活水平的不断提高，对啤酒的需求量越来越大，对啤酒质量的要求也在不断提高。酵母菌种的好坏对啤酒的质量起着至关重要的作用，可以说酵母是啤酒的灵魂。高质量的啤酒当然需要性能优良的酵母菌种。 选择优良的酵母菌种，要综合考虑它的性状，包括繁殖能力、发酵速度和能力、代谢物对啤酒风味的影响、酵母的生存能力、酵母菌种的稳定性以及生产的啤酒的综合风味等。因此选育优良酵母菌种成为当今高速发展的啤酒业的需要。对酵母菌株的育种和筛选经历了一个由浅至深的过程，从根据酵母的生长代谢以及发酵能力分离较好菌种，到通过诱变进行筛选，再到细胞水平上的杂交。当今，随着生物技术的高速发展，在充分分析酵母代谢的基础上，通过分子手段来构建酵母的工程菌，使酵母拥有更多的人们希望的性能正在进行着。这很大程度上改善着啤酒的品质，给啤酒业带来了很大的便利和机遇。对酵母基因的操作一般分为两步：一是通过代谢工程来分析细胞的代谢过程，来寻求最有可能最有希望的目标，然后通过基因工程来进行基因操作，改变基因结构、删除基因或导入一新的基因。目前通过基因重组技术来改变酵母菌种的遗传特性，使它具有生产所需要的某些优良性状，在许多方面都取得了很大进展。对酵母进行的基因改造有下几个方面：1.对碳源的充分利用将曲霉菌（aspergillusniger）和乳酸克鲁维酵母（kluyveromycesmarxianus）的b-半乳醣苷酶转入酿酒酵母，使酵母可以高效率的将乳糖转化为乙醇。将裂殖酵母（schizosaccharomycespombe）的苹果酸通透酶基因转入啤酒酵母，使酵母可以顺利的降解苹果酸。将芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）的编码淀粉酶的基因和肺炎克雷氏菌（klebsiellapneumoniae）编码葡糖淀粉酶的基因转入啤酒酵母，使酵母有效的利用淀粉和糊精。将树干毕赤酵母（pichiastipitis）的木糖还原酶基因xyl1和xyl2转入啤酒酵母，使其能够利用木糖。2.提高酵母的生产力和消除酵母发酵过程中的副产物 其中包括双乙酰的消除，啤酒酵母本身不含α-乙酰乳酸脱羧酶，将枯草芽孢杆菌等编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆或整合到啤酒酵母中，可大大减少双乙酰的形成。通过改变厌氧条件下对甘油的降解，可以提高酵母的发酵度。3.提高啤酒生产的操作性 改善酵母凝聚性的菌种：将控制凝聚性的基因主要是flo1基因转移到非凝聚性酵母中，改善其凝聚性，发酵后便于收集酵母，啤酒过滤快。将木霉（trichodermareesei）或枯草芽孢杆菌（b.subtilis）编码β-葡聚糖酶的基因转移到啤酒酵母中，使啤酒中的高分子β-葡聚糖得以分解，降低啤酒粘度，加快啤酒过滤速度。4.用酵母来生产一些在原生物体中产量很低的蛋白 从1981年hitzeman第一次用酿酒酵母表达人重组干扰素基因开始，到目前利用酿酒酵母为宿主系统表达了多种外源基因产物，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等。当今生物技术正快速发展，对酵母的改造研究也快速进行中。 二、β-葡聚糖酶工程菌构建酿造啤酒的主要原料大麦中的β-葡聚糖含量在2-6%之间[jin,2002.]，也有些认为4-8%[henry,1985]，因大麦栽培状况和基因型的不同而不同[molina,1982]。在啤酒酿造过程中，麦芽中一部分β-葡聚糖进入麦芽汁，最终进入啤酒，但会增加麦芽汁的黏度。高黏度的麦芽汁以及一部分没有溶解的β-葡聚糖甚至有些溶解的β-葡聚糖都会造成麦芽汁和啤酒过滤困难[eyben,1979]。麦芽中高含量的β-葡聚糖是由于细胞壁分解的不完全，将阻滞其它贮存物质的移动，使一部分淀粉和蛋白被滞留在细胞内，最终造成浸出物的降低[kato,1995]。在生产纯生等特制啤酒时，由于微孔滤膜的孔非常小，所以β-葡聚糖对过滤的影响比传统的啤酒酿造会产生更大的影响。麦芽汁以及啤酒的高黏度以及β-葡聚糖分子会造成微孔滤膜的阻塞[ichikawa,1992]。因此，酿造啤酒时啤酒以及麦芽中β-葡聚糖的含量引起人们越来越的关注。 大麦中大部分的β-葡聚糖的结构是被β-1,3–键间隔开来纤维三糖和纤维四糖（2~4个葡萄糖单位β-1,4-键相连的寡聚葡聚糖）的重复结构[buliga1986]。有少部分β-葡聚糖由β-l,4-连接而成的葡萄糖寡聚体中有更多的葡萄糖残基个数，最多可达20个左右，而且也认为这些被β-l,4-键相连的葡聚寡糖链会降低β-葡聚糖的水溶性[izawa1990]。图1大麦中的葡聚糖主要结构以及β-葡聚糖酶的作用方式 研究认为β-葡聚糖链会在麦芽生产和发酵过程中重新相互连接，特别是在冷冻和解冻的反复处理过程中，会造成β-葡聚糖分子变得更大。在啤酒酿造过程中的一些处理步骤可以使β-葡聚糖相互连接而形成更大的分子，izawa等的研究认为经过冷冻和解冻处理后出现的β-葡聚糖分子一般大于200,000，分子量大于200,000的β-葡聚糖分子与啤酒中的雾状沉淀的形成有关[izawa,1990]，也有研究认为小分子的β-葡聚糖分子也对沉淀的产生有促进作用[letters,1977]。β-葡聚糖的浓度和正常分子大小的β-葡聚糖都是影响啤酒过滤的重要因素[jin,2002]。β-葡聚糖是啤酒产生雾状沉淀的一个重要因素[yu-laijin,2004]。特别是干啤和冰啤酿造过程中，过滤时出现的大分子β-葡聚糖和雾状沉淀问题更加突出[narziss,1973]。 β-葡聚糖酶是破解大麦胚乳细胞壁的主要酶类。β-葡聚糖酶是酶系家族：有β-1,3-1,4-葡聚糖酶，β-1,3-葡聚糖酶，β-1,2-1,4-葡聚糖酶，β-l,4-葡聚糖酶，β-1,3-1,6-葡聚糖酶[kato,1995]。大麦β-葡聚糖的溶解是从胚乳细胞壁的溶解开始的，在干燥的大麦原料中也存在β-葡聚糖溶解酶（β--glucansolubilase）活性，其活性会在发芽过程中增加1.5-1.7倍，β-葡聚糖的含量会因为被β-葡聚糖酶水解而降低[bamforth,1994]。麦芽中β-葡聚糖酶的活性受到多方面因素的影响，比如，大麦的品种、大麦保存的年限以及大麦栽培和麦芽制备的条件。未发芽大麦中的β-葡聚糖酶的活性的高低会一定程度上影响制麦过程中β-葡聚糖的水解以及麦汁和啤酒的黏度[bathgate,1974]。制麦芽过程中β-葡聚糖的降解主要是受酶活影响，在浸泡过程中β-葡聚糖的含量基本没有变化，在发芽的前三天有一明显的下降幅度，但是在随后的发芽阶段和烘焙阶段基本不再减少[bamforth,1985]。长时间高温的浸泡过程虽然可以降低麦芽汁中β-葡聚糖的含量和分子大小，但也会造成浸出物减少等不良影响，所以更多的麦芽生产都是在低温条件下对大麦进行浸泡[[nischwitz,1999]。